免疫组化的发展

近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。

在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是在肿瘤诊断和鉴别诊断中，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。

免疫组化的用处

1.疑难病例诊断和鉴别诊断；  

2.确定转移性恶性肿瘤的原发部位；                  

3.对某类肿瘤进行进一步的病理分型；

4.判断肿瘤的预后；

5.为临床医生的治疗提供据。（如果ER、PR阳性，手术切除以后可以后续行内分泌治疗，也就是三苯氧胺。如果Her-2阳性，可以行分子靶向治疗，赫赛汀。如果都是阴性，这些治疗就都没有意义）。

免疫组化的方法

1.免疫荧光方法

2.免疫酶标方法（ABC法、SP三步法、即用型二步法等）

3.免疫胶体金技术

两步法

两步免疫组化染色法是过氧化物酶标记的多聚体与抗鼠或兔IgG的二抗相连，操作时只需进行一抗和二抗两步孵育。

操作方法

1.免疫组化染色机

常见免疫组化仪

免疫组化机优势

现代化的病理科实验室对效率、成本、质量和结果重复性等方面的要求愈来愈高，解决方案就是免疫组化试剂的标准化和染色的自动化。

1.自动免疫组化染色机规范了染色的操作步骤和方法，方法稳定，结果重复性较佳；

2.部分机型由于使用了增敏试剂，提高了敏感性；

3.由于采用独特的抗体覆盖系统，抗原抗体反应较为均匀，反应时间相应缩短；

4.缓冲液的均一洗涤降低了非特异性背景染色；

5.自动控制各种抗体和试剂加样，减少了人工操作。

2.手工操作染片

免疫组化步骤

1修复

经甲醛固定的组织常引起蛋白质空间结构的改变而导致抗原决定簇的封闭,抗原修复技术在石蜡切片免疫组织化学染色中是一种简单有效的增强方法。

目前常用的修复方法：高温柠檬酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA（PH9.0和PH8.0）

2阻断

有些组织富含过氧化物酶，为避免DAB显色时干扰外源性过氧化物酶参与呈色反应背景显色比较深。为了防止其发生一般会把修复完的玻片做以下处理。

置于0.3%～3%的过氧化氢甲醇溶液中阻断12～20min。

3一抗

一抗：特异结合底物，识别出我们想要检测的抗原。

室内温度 ：孵育 1-2h，PBS 3×3min

4二抗

二抗:和一抗结合，检测一抗。为酶标记羊抗小鼠/兔IgG聚合物。  

室内温度：孵育 18min左右。PBS  3x3min

5 DAB显色

DAB（二氨基联苯胺）是过氧化物酶的常用底物。在 过氧化物酶的催化下，DAB 会产生棕色沉淀该棕色沉淀不溶于水和乙醇。

室温下显色3～5min。

合格的染片

胞核

胞质

胞膜

常见的染色不佳

1.背景着色;

2.着色不均用;

3.出现假阴性。

背景着色

1.内源性过氧化物酶丰富，如肝脏；

2.切片在染色过程中干燥过，特别是在孵育过程中干燥。无法补救；

3.黏贴剂的浓度过高；

4.抗体浓度过高或孵育时间过长；

5.显色剂浓度过高或显色时间过长；

6.缓冲液洗涤不够干净。

着色不均匀

1.脱蜡不干净；

2.抗体或显色剂加的太少，有的地方没有覆盖到或已干燥；

3.湿盒不平，导致切片倾斜，有的部位已干燥；

4.抗体稀释时没均匀；

5.抗体发霉或稀释抗体用的缓冲液发霉。

出现假阴性

1.固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救；

2.一抗体没加或加错；

3.二抗没加或二抗加错；

4.抗体浓度过低；

5.孵育的时间太短或孵育温度太低；

6.抗体本身的特异性；

7.修复方法有误或处理时间不正确；

8.缓冲液PH值不正确。

免疫组化的质控片

每日质控：一般设有阴性、阳性对照。

 作用：防止假阳性，假阴性的发生。

 同时每一批次的抗体我们都要做一抗质控；二抗质控。

 阳性对照片一般选择++的。